손을 잡고 가르쳐 주는 DNA 클로닝

클로닝의 정의
새로운 유전자의 발굴
과거의 클로닝
현재의 클로닝
cDNA library
RACE
클로닝 설계에 유용한 소프트웨어
Vector, plasmid & construct
Restriction enzyme
Multiple Cloning Sites (MCS)
새로운 plasmid를 받았을 때
Cut & Paste
LB plate 만들기
Star activity
Competent cells
Fill-in (Full & Partial)
Compatible cohesive ends
Methylation
Agarose gel electrophoresis
Three-piece ligation
PCR
Site-directed mutagenesis
유전자 중간부분에 삽입하는 방법
유전자의 중간부분을 삭제하는 방법
유전자의 처음이나 끝에 epitope tag을 삽입하는 방법
DNA의 질량을 molar 농도로 바꾸는 법
TA cloning
T vector의 제작
TOPO TA cloning
Gateway cloning
Translational Fusion Vs. Transcriptional Fusion
BAC recombineering
DNA sequencing
다른 종에서 유사한 유전자를 클로닝하는 방법
Old trick: partial digestion
클로닝이 다 됐다고 생각했는데, frame shift가 있을 때
클로닝의 실제: 억세게 운이 없는 경우
벡터의 변경
클로닝이 안될 때
클로닝의 정리와 기록
심화학습을 위한 문헌

클로닝의 정의
우리가 실험실에서 쓰는 “클로닝 (cloning)”이라는 말은, 쓰는 사람에 따라서 그 의미가 다르다. 동물복제를 클로닝이라고 하는 사람도 있고, 새로운 유전자를 발굴하는 작업 자체를 클로닝이라고 하는 사람도 있고, 이미 plasmid에 있는 유전자를 다른 plasmid로 옮기거나 (정확하게는 subcloning) 변형시키는 것을 클로닝이라고 하는 사람도 있다. 이 책에서는 주로 유전자를 옮기거나 변형시키는 것을 다룰 것이고, 새로운 유전자를 발굴하는 작업도 약간 언급할 것이다.

새로운 유전자의 발굴
Molecular Biology가 태동했던 1980년대와 1990년 초반만 하더라도 새로운 유전자를 발굴하는 것은 쉽지 않은 일이었다. 따라서 하나의 새로운 유전자를 발굴하면, 그것만을 가지고 논문을 쓸 수 있었고, 당시 Journal of Biological Chemistry 같은 잡지를 보면 이러한 논문을 무수히 많이 볼 수 있다. 이러한 논문에 항상 등장하는 그림은 아래와 같은 것이다 (그림 1). Nucleotide sequence and its deduced amino acid sequence. 내가 실험실 생활을 처음 시작했을 때 나에게 공포를 준 그림이 이러한 것이다. 공포스럽지 않은가?

과거의 클로닝
과거에 새로운 유전자를 발굴하기 위해서는 매우 복잡한 과정을 거쳤다. cDNA library screening, degenerate PCR, RACE (rapid amplification of cDNA ends) 등등이 있다. 운이 좋지 않은 경우는, 많은 노력에도 불구하고 클로닝에 성공하지 못한 경우도 적지 않았다.
또한 PCR (polymerase chain reaction)이 광범위하게 사용되지 않았고, cloning plasmid에 존재하는 restriction enzyme의 종류도 많지 않았기 때문에 subcloning도 쉽지 않았다. 또한 Stratagene에서 나온 Quick-change site-directed mutagenesis 기술이 알려지지 않았기 때문에, 전체 유전자에서 한 개의 nucleotide를 변형, 삭제 및 첨가하는 것은 매우 복잡했다.

현재의 클로닝
다음과 같은 신기술의 등장으로 현재의 클로닝이 매우 손쉬워졌다 (물론 아직도 어렵다고 생각하는 사람이 있고, 그런 사람을 위해서 이 책이 나왔다.)
1. Polymerase Chain Reaction (PCR)
2. Expressed Sequence Tag (EST)

PCR은 1984년 Kary Mullis에 의해 개발된 기술이며, Molecular Biology에 일대 혁명을 가지고 왔다. 그 공로로 1993년 노벨상을 수상하였다. PCR은 subcloning 부분에서도 일대 혁신을 가지고 왔다. PCR이 보편화되기 전에는 subcloning에 정말 많은 tip이 있었으나 (“Old trick"편 참고), PCR은 그러한 tip들을 일거에 불필요하게 만들어 버렸다.
EST는 Craig Venter가 개발하여 1991년 발표한 기술인데, 그 개념은 간단하다. 세포나 조직에서 mRNA를 추출하고 (그림 2의 step 1) random primer나 oligo(dT)를 이용하여 reverse transcriptase (RT)로 cDNA를 합성한 후에 (step 2), RNase를 처리하여 mRNA를 제거한다 (step 3). 합성된 cDNA의 3 end에 linker를 붙이고 (step 4) 이 linker와 oligo(dT)를 이용하여 PCR을 시행하여 double stranded DNA (dsDNA)를 합성한다 (step 5). 이렇게 합성된 dsDNA를 cloning vector (가령 예를 들면 pBluescript)에 넣고, 양쪽에 있는 SP6나 T7 sequencing primer 같은 것으로 sequencing을 한 것을 EST라고 한다 (그림 3 참조). 즉 EST는 DNA sequencing의 결과물을 말한다. 그러나 흔히 EST라고 하면 cloning vector에 mRNA의 RT 산물이 들어가 있는 construct (흔히들 clone이라고 말한다)를 말한다.
High throughput으로 sequencing을 하다 보면, 1회 sequencing으로 읽을 수 있는 길이가 600 bp가 못되는 경우도 많다. 실험실에서 하나씩 sequencing을 해도 한번에 900 bp 이상을 읽기는 쉽지 않다. 따라서 원래 mRNA의 길이가 2 kb 이상이 되면 양쪽에서 SP6와 T7으로 sequencing을 해도 RT산물인 dsDNA 전체를 다 읽을 수 없게 된다. 삽입된 dsDNA 전체를 EST가 cover하지 못하는 경우는, 그 clone을 가져다가 internal primer를 사용해서 자신이 직접 sequencing하는 수밖에 없다.
상기한 것처럼 EST database에 있는 sequence는 어떤 mRNA의 full sequence를 가지고 있는 경우는 매우 드물다. 이러한 EST의 성질은 일견 단점으로 보이지만, 바로 이 성질 때문에 human genome project의 완성을 크게 앞당겼다. 수없이 많은 mRNA을 짧은 시간 안에 cloning vector에 올리고 그 양 말단만을 읽음으로서, 단시간 안에 genome의 구조를 아는데 큰 기여를 한 것이다.
이미 눈치를 챘겠지만, EST는 mRNA의 정보를 보여주는 sequence이다. 즉 genome 중에서 transcription 되는 영역만을 보여준다. 우리 연구자 입장에서는 whole genome에 관심이 있는 경우보다는 transcription되는 genome area (즉 mRNA)에 관심이 있는 경우가 훨씬 더 많다. 따라서 EST의 등장으로 새로운 유전자의 클로닝이 매우 쉬워져서, 새로운 유전자를 cloning하는 일을 하는 연구자에게는 큰 행운이었다. 즉 연구자가 A라는 유전자의 cDNA를 원할 경우, EST database를 탐색하여 A 유전자가 있는지 조사하고, 있을 경우 해당 EST가 full length clone인지 확인한다. 이 확인 작업은 EST가 A 유전자의 5 & 3 end를 모두 가지고 있는지를 조사하는 것이다. Full length인 것으로 확인이 되면, Open Biosystems (https://www.openbiosystems.com/) 이나 ATCC (https://www.atcc.org/) 와 같은 회사에 주문하면 된다. 이러한 회사들은 대부분 우리나라에 대행사를 가지고 있다.
이러한 방식은 사실 클로닝이라고 말하는 것보다는, “클론을 구입했다”라고 말하는 것이 더 옳을 것이다. 아직도 금전적인 문제로 클론을 구입하기 보다는 RT-PCR을 통해서 전통적인 방법으로 클로닝을 하는 것을 선호하는 사람이 많이 있다. 그러나 RT-PCR에 소요되는 시간, 시약비, DNA sequencing 비용 등을 고려하면, 클론을 구입하는 것이 그렇게 비싼 방법은 아니다.
1999년에 EST라는 말을 책에서 처음 접하고 왜 이것을 “expressed sequence tag”이라고 부를까 하고 고민한 적이 있었다. 그 당시에는 도저히 이해할 수 없었는데, 지금 생각해 보니 간단하다. mRNA에서 만든 것이므로 “expression”된 것이고, sequencing결과이므로 “sequence”라고 한 것이고, 그 sequence가 긴 것이 아니고 짧은 것이므로 (상기한 것처럼 한번 sequencing으로 읽을 수 있는 nucleotide는 900 bp를 넘기 어렵다) “tag”이라고 한 것이다.